Раз в месяц мы отправляем дайджест с самыми популярными статьями.

РОЛЬ ОКИСЛЕННОГО АЛЬБУМИНА В АГРЕГАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ

М.Н. Егорихина, Г.Я. Левин 

ФГБУ «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия

 

Изучали влияние степени окисления альбумина на агрегацию и дезагрегацию эритроцитов. Выявлена корреляция  изменения агрегации красных клеток крови и степени окисленности альбумина. Рассмотрены возможные механизмы данных эффектов.

Ключевые слова: окисленный альбумин, агрегация эритроцитов

 

We studied the influence of albumin oxidation rate on aggregation and disaggregation of erythrocytes. The changes in red blood cell aggregation associated with oxidation rate of albumin were found. Possible mechanisms of these effects are investigated.

Key words: oxidized albumin, erythrocyte aggregation

 

Известно, что при патологических состояниях, сопровождающихся усилением свободно-радикальных процессов, субстратом действия активных форм кислорода являются не только липиды, но и белки [1, 2]. В большинстве работ, где изучалось влияние белков окислительной модификации на агрегацию клеток крови, исследовался лишь окисленный фибриноген. Практически нет исследований, посвященных изучению влияния окисленных сывороточных белков на агрегационные свойства эритроцитов, в частности альбумина, который составляет примерно 60% от общего количества белков плазмы крови.

Материалы и методы. Исследование проведено на  20 образцах крови здоровых людей. Для получения сыворотки кровь забирали в вакуумные пробирки (BDVacutainer®SSTTMII), спустя 30мин. кровь центрифугировали 10 мин. при 3000 об./мин. Для исследования агрегации эритроцитов использовали кровь, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия (9:1). Спонтанную агрегацию эритроцитов изучали в искусственном сдвиговом потоке на приборе собственной конструкции (патент № 2278381), в котором использован принцип, предложенный H. Schmid-Schönbein et. al. (1973), с регистрацией процесса на самописце. Для окислительной модификации раствор альбумина (5%) подвергали УФ-облучению. Контроль за степенью окислительной модификации раствора альбумина проводили по методике Levine R.L. et.al. [3] в модификации Дубининой Е.Е. и соавт. [4]. Каждая серия экспериментов с альбумином различной окисленности проводилась на крови одного донора. Результаты исследований обработаны методами непараметрической статистики с применением критерия Вилкоксона.

Результаты и обсуждение. Окисленный альбумин вызывал увеличение агрегации эритроцитов и повышение прочности их агрегатов (табл. 1). Причем и скорость, и степень агрегации эритроцитов увеличивались по мере нарастания степени окисления альбумина. Дезагрегация эритроцитов также снижалась, особенно на низких скоростях сдвига, под действием окисленного альбумина.

Мнение по поводу действия альбумина на агрегацию клеток крови неоднозначно, однако тот факт, что он влияет на агрегацию, не вызывает сомнения. Известно, что среди белков сыворотки крови альбумин является наиболее чувствительным к окислительной модификации [5]. Учитывая вышеперечисленные положения, мы исследовали влияние окисленного альбумина на агрегационные свойства эритроцитов.

Известно, что большое количество рецепторов к различным лигандам обнаружено на мембранах и тромбоцитов и эритроцитов [6-8]. Однако механизм агрегации этих клеток крови значительно различается. Агрегацию тромбоцитов определяет, прежде всего, состояние “фибриногеновых” рецепторов — GP IIb/IIIa. Механизм агрегации эритроцитов несколько иной. Хотя на мембранах эритроцитов также имеются рецепторы, специфически взаимодействующие с фибриногеном, они лишь на 18% определяют агрегацию красных клеток крови [9]. В настоящее время наиболее признанной теорией, объясняющей механизм агрегации эритроцитов, остается “мостиковая”, или теория макромолекулярного связывания, согласно которой агрегационный процесс обусловлен адсорбцией на поверхности эритроцитов  крупномолекулярных белков [10]. Также известно, что отсутствие фибриногена, например, в сыворотке крови, лишь снижает, но не предотвращает агрегацию эритроцитов [11]. В этом случае агрегация обусловлена другими высокомолекулярными белками.

 

Таблица 1. Влияние окисленного альбумина на агрегацию и дезагрегацию эритроцитов

Степень окисления альбумина (ЕД / 1 мг альбумина /1 мл раствора)

агрегация

эритроцитов

дезагрегация

эритроцитов

Ма (мм)

А40 (мм)

D10 (%)

D15 (%)

D20 (%)

36,45±2,61

(контроль)

(n=10)

72,14

±3,89

9,29

±0,97

92,34

±4,83

95,09

±2,92

99,01

±0,99

52,18±4,82

(n=10)

81,71

±5,55*

11,88

±1,64

77,35

±6,83*

90,97

±5,18

99,27

±0,73

61,20±6,03

(n=10)

92,14

±6,82*

18,29

±3,60*

72,26

±6,12*

85,96

±3,98

98,51

±1,49

71,18±6,68

(n=10)

94,43

±5,65*

13,86

±0,88*

58,19

±6,06*

73,14

±6,68*

89,34

±6,11

Примечание: * – р<0,05, сравнение с контролем. критерий Вилкоксона.

 

Нами установлено, что увеличение степени окисления альбумина усиливает агрегацию эритроцитов и прочность их агрегатов. Известно, что белки, подвергшиеся окислительной модификации, могут формировать агрегаты.  Процесс агрегации белков при окислении обусловлен нарушением нативной конформации ряда их доменов, в результате чего увеличивается число гидрофобных остатков на поверхности глобул, что и определяет формирование крупных белковых конгломератов [12]. Показано, что олигомеры и полимеры альбумина являются проагрегантами эритроцитов [13]. В связи с этим для объяснения полученных результатов можно предложить следующую модель. При окислении молекулы альбумина формируют достаточно крупные конгломераты, которые имеют молекулярную массу, достаточную для усиления агрегации эритроцитов. Следует отметить, что молекула альбумина, также как и молекула фибриногена, имеет отрицательный заряд, в то же время эти молекулы обладают дипольным моментом, то есть в одной части молекулы “скапливается” больше групп с отрицательным зарядом, а в другой – с положительным, что приводит к возникновению разности потенциалов на разных участках молекулы [14]. Известно, что в результате окисления в белках происходят локальные конформационные превращения, появляются новые полярные химические группировки (например, карбонильные), что также может способствовать перераспределению заряда молекулы [15б 16]. Все это, по-видимому, дает возможность молекулам осуществлять диполь-дипольное притяжение за счет сил Ван-дер-Ваальса как между собой, так и между клетками, что согласуется с “мостиковой” теорией.

Есть данные, что окисленные белки сами могут выступать в качестве стимуляторов перекисного окисления липидов [17]. Возможно, что окисленный альбумин, может вызывать, как и в случае окислительного стресса, перемещение фосфолипидов, локализованных на внутренней стороне мембраны, кнаружи [18]. Таким образом, механизм неспецифической агрегация эритроцитов может реализовываться при участии находящегося на внешней стороне мембраны эритроцита фосфатидилсерина, который способен связываться с фибриногеном и, возможно, с конгломератами окисленного альбумина. Это согласуется с данными о повышении неспецифической агрегации эритроцитов при увеличении концентрации фосфатидилсерина на внешней стороне их мембраны [19, 20]. Таким образом, по мере увеличения окисленности альбумина возрастает количество его конгломератов, то есть повышается количество молекул с высокой молекулярной массой, обладающих проагрегатными свойствами, что вызывает прогрессивное возрастание агрегации эритроцитов, а так же увеличение прочность их агрегатов. При этом окисленный альбумин за счет перемещения фосфотидилсерина с внутренней на внешнюю сторону мембран, может дополнительно стимулировать агрегацию.

Вывод: окисление альбумина вызывает возрастание агрегации эритроцитов и усиление прочности эритроцитарных агрегатов.

Список литературы:

  1. Dean RT, Hunt JV, Grant AJ, Yamamoto Y, Niki E. Free radical damage to proteins: the influence of the relative localization of radical generation, antioxidants, and target proteins // Free Rad Biol Med 1991; 11(2); 161-168.
  2. de Zwart LL, Meerman JHN, Commandeur JNM, Vermeulen NPE. Review: Biomarkers of Free Radical Damage: Applications in Experimental Animals and in Humans // Free Rad Biol Med 1999; 26: 202-226.
  3. Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz AG, Ahn BW, Shaltiel S, Stadtman ER. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins // Meth Enzymol 1990;186: 464-478.
  4. Dubinina EE, Burmistrov SO, Hodov DA, Porotov IG. Oxidative modification of serum proteins of the human, a method of its definition // Probl Med Chem 1995; 41(1): 24-26.
  5. Smith CA, Halliwell B, Aruoma OI. Protection by albumin against the prooxidant actions of phenolic dietary components // Food Chem Toxicol 1992; 30: 483-489.
  6. RiveraJ, Lozano ML, Navarro-Núñez L,Vicente V. Platelet receptors and signaling in the dynamics of thrombus formation // Haematologica 2009; 94(5): 700-711.
  7. Saenko EL, Yaropolov AI. Studies on receptor interaction of ceruloplasmin with human red blood cells // Biochem Int 1990; 20(2): 215-225.
  8. Sakashita K, Oonishi T, Ishioka N, Uyeska N. Endothelin-l improves the impaired filterability of red blood cells through the activation of protein kinase C // Jpn J Physiol 1999; 49: 113-120.
  9. Lominadze D, Dean WL. Involvement of fibrinogen specific binding erythrocyte aggregation // FEBS 2002; 517: 41-44.
  10. Brooks DE: Mechanism of red cell aggregation. Red blood cell, rheology and aging. Edited by Piatt D. Berlin, Springer Verlag, 1988. pp. 158-162.
  11. Shin S, Park MS, Jung JH, Ku YH, Suh JS. Measurement of red blood cell aggregation by analysis of light transmission in a pressure-driven slit flow system // Korea-Australia Rheological Journal 2004; 16(3): 129-134.
  12. Davies KJA, Delsignore ME, Lin SW. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects. II. Modification of amino acids. III. Modification of secondary and tertiary structure. IV. Degradation of denatured protein // J Biol Chem 1987; 262(20): 9895-9920.
  13. Forsdyke DR, Palfree RGE, Takeda A. Formation of erythrocyte rouleaux in preheated normal serum: roles of albumin polymers and lysophosphatidylcholine // Can J Biochem 1982; 60(7): 705-711.
  14. Seyrek E, Dubin PL, Tribet C, Gamble E. Ionic strength dependence of protein-polyelectrolyte interactions // Biomacromolecules 2003; 4: 273-282.
  15. Rosenfeld MA, Leonova VB, Konstantinova ML, Razumovskii SD. Self-assembly of fibrin monomer molecules and fibrinogen aggregation after ozone oxidation. Biochemistry (Moscow) 2009; 74(1): 54-61.
  16. Bcrlctt BS, Lcvine RL, Stadman ER. Comparison of the effects of ozone on the modification of amino acid residues in glutamine synthetase and bovine serum albumin // J Вiol Chem1996; 271: 4177-4182.
  17. MiayataT, Inagi R, Asahi K, Yamada Y, Horie K, Uchida K, Kurokawa K. Generation of protein carbonyls by glycoxidation and lipoxidation reactions with autoxidation products of ascorbic acid and polyunsaturated fatty acids // FEBS Lett 1998; 437(1-2): 24-28.
  18. Freikman I, Ringel I, Fibach E. Oxidative Stress-Induced Membrane Sheddingfrom RBCs is Ca Flux-Mediated and Affects Membrane Lipid Composition // J Membr Biol 2011; 240(2):73-82.
  19. Junker M, Creutz СЕ. Ca(2+)-dependent binding of endonexin (annexin IV) to membranes: analysis of the effects of membrane lipid composition and development of a predictive model for the binding interaction // Biochemistry 1994; 33(30): 8930-8940.
  20. Wolfs JL, Comfurius P, Bevers EM, Zwaal RF. Influence of erythrocyte shape on the rate of Ca2+ — induced scrambling of phosphatidylserine // Mol Membr Biol 2003; 20(1):83-91.