Раз в месяц мы отправляем дайджест с самыми популярными статьями.

Влияние хронического стресса на электрокинетические свойства и окислительный метаболизм эритроцитов

А.В. Дерюгина1, А.А. Мартусевич2, Е.А. Антипенко3, Т.А. Веселова1

 

1 ФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород

2 ФГБУ «Приволжский Федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, Нижний Новгород

3 ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России, Нижний Новгород

 

Abstract

The aim of this study was investigation of changes of elecrophoretic motility (EPM) and oxidative metabolism of erythrocytes under chronic stress. The experimental part of the work included modeling of global and local cerebral ischemia in rats. Global cerebral ischemia was modeled by one-step irreversible bilateral occlusion of the common carotid arteries (n = 20). Local cerebral ischemia was induced by occlusion of the left branch of irreversible middle cerebral artery and a vein suitable for her simultaneous ligation of the ipsilateral carotid artery (n = 20). Clinical part of work included evaluation of 390 patients with chronic cerebral ischemia. In blood samples from animals and humans we investigated EPM and level of malonic dialdehyde, common, oxidated and restored glutathione in erythrocytes. It was stated that character of EPM changes demonstrates the inclusion of stress-releasing systems of the organism and associated with stress response. On early stages of adaptation the glutathione acts as a non-specific of antioxidant system.

 

Key words: stress, erythrocyte electrophoretic motility, malonic dialdehyde, glutathione

 

Целью работы явилось исследование закономерностей реагирования электрофоретической подвижности (ЭФПЭ) и окислительного метаболизма эритроцитов при действии хронического стресса. Экспериментальная часть работы включала моделирование глобальной и локальной ишемии головного мозга у крыс. Глобальную ишемию головного мозга моделировали путем необратимой одномоментной двусторонней окклюзии общих сонных артерий (n=20). Локальную ишемию головного мозга вызывали путем необратимой окклюзии левой ветви средней мозговой артерии и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии (n=20). Клиническая часть работы включала обследование больных дисциркуляторной энцефалопатией I, II или III стадии (n=390). В крови лабораторных животных и людей исследовали ЭФПЭ, концентрацию МДА, общего, окисленного и восстановленного глутатиона в эритроцитах. Установлено, что характер и выраженность изменений ЭФПЭ являются отражением вовлечения стресс-реализующих систем организма и сопряжены с развитием стресс-реакции, тогда как система глутатиона работает как неспецифическое звено антиоксидантной системы на начальных стадиях адаптационного синдрома.

 

Ключевые слова: стресс, электрофоретическая подвижность эритроцитов, малоновый диальдегид, глутатион

 

Реакция организма на стресс обеспечивается двухкомпонентной системой, которая, с одной стороны, специфически реагирует на конкретный тип раздражителя, а также стресс-реализующими адренергической и гипофизарно-адреналовой системами, неспецифически реагирующими в ответ на изменения в среде [7]. Однако на сегодняшний день экспериментальные данные относительно влияния длительных и, особенно, многократно действующих тяжелых стрессоров на состояние гипофизарно-адренокортикальной системы носят противоречивый характер. Обнаружено снижение активации адренергической и гипофизарно-адреналовой систем [12, 13], либо усиление ее ответа [9, 15], в ряде работ изменение активности гипофизарно-адренокортикальной системы не обнаружено [8, 10].

Ранее нами при изучении реакции организма на острый стресс было выявлено закономерное стереотипно повторяющееся изменение электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) в ответ на активацию симпатоадреналовой и гипофизарно-надпочечниковой систем [2]. При этом степень вовлечения стресс-реализующих систем определяло глубину изменения данного показателя. Кроме того, было показано, что типовые изменения ЭФПЭ, как показателя состояния мембран эритроцитов, реализуются через типовые структурные перестройки мембран эритроцитов, зависящих от состояния процессов свободнорадикального окисления [3].

Целью данной работы явилось исследование закономерностей реагирования электрофоретической подвижности и окислительного метаболизма эритроцитов при действии хронического стресса.

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы проведена на 60 нелинейных белых крысах-самках массой 200-250 г. Животные содержались в виварии при свободном доступе к пище и воде и естественной смене дня и ночи. До начала эксперимента все животные прошли карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение 14 суток.

У животных моделировали локальную и глобальную ишемии головного мозга. Глобальную ишемию головного мозга моделировали путем необратимой одномоментной двусторонней окклюзии общих сонных артерий (n=20). Локальную ишемию головного мозга вызывали путем необратимой окклюзии левой ветви средней мозговой артерии и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии (n=20). Окклюзия достигалась путем электрокоагуляции аппаратом электрохирургическим высокочастотным ФОТЕК Е81. Работу проводили под нембуталовым наркозом (нембутал внутрибрюшинное введение 35 мг/кг). После операции рану обрабатывали сухой калийной солью пенициллина, кожу ушивали, шов обрабатывали 2% раствором йода. Контролем служили интактные крысы (n=20). У животных всех групп проводили получение образцов через 15 мин, 2, 24 часа, 10, 60 суток после воздействия.

Клиническая часть работы включала обследование больных дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) на I, II, и III стадии заболевания. Возраст больных колебался от 35 до 55 лет (средний возраст 47,7±5,6 лет). Было обследовано 128 больных с ДЭ I стадии, среди них было 90 женщин и 38 мужчин (1 группа); 132 пациента с ДЭ II стадии, среди них было 94 женщины и 38 мужчин (2 группа) и 130 пациентов ДЭ III стадии из них 76 женщин и 62 мужчины (3 группа). Диагноз формулировался в соответствии с общепринятыми клиническими критериями и подтверждался данными нейровизуализации. Группу контроля составили 50 здоровых добровольцев в возрасте от 35 до 55 лет (средний возраст 46,7±6,2 года). Среди них было 37 женщин и 13 мужчин.

В крови лабораторных животных и людей исследовали ЭФПЭ, концентрацию МДА, общего, окисленного и восстановленного глутатиона в эритроцитах [14].

Измерение ЭФПЭ проводили методом микроэлектрофореза [4], регистрируя время прохождения эритроцитов расстояния 10 мкм в трис-НСl буфере с рН 7,4 при силе тока 8 мА. Величину ЭФПЭ определяли по формуле:

U= S/TH,

где S – расстояние, на которое перемещались клетки, Т – время перемещения клеток на расстояние S, Н – градиент потенциала.

 

Величину градиента потенциала определяли по формуле:

Н=I/gχ,

где I – сила тока, g – поперечное сечение камеры, χ – удельная электропроводимость среды.

 

Полученные данные были обработаны статистически в программном пакете Statistica 6.1 for Windows. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскала-Уоллеса.

Результаты исследований

Учитывая, что гипоксия ткани головного мозга при хронической ишемии может рассматриваться как длительно действующий стрессовый фактор [11] изучение ЭФПЭ было проведено при исследовании развития хронического стресса в ходе моделирования локальной и глобальной ишемии головного мозга крыс.

В ходе исследования крови крыс было установлено, что ЭФПЭ животных в течение первых суток изменялась недостоверно с последующим понижением в течение 10 дней после альтерации организма более чем на 30% относительно значений интактных крыс (рис. 1, табл. 1).

 

Рис. 1. Изменение ЭФПЭ, концентрации МДА и общего глутатиона при хронической ишемии головного мозга крыс

По оси ординат — % изменения уровня исследуемых показателей, к 100 % — уровня значений интактной группы животных.

По оси абсцисс – время после воздействия, сутки.

 

Через 60 суток после моделирования как глобальной, так и локальной ишемии головного мозга ЭФПЭ была существенно повышена по сравнению с интактными животными (p<0.05). При этом наиболее выраженные изменения ЭФПЭ проявлялись при локальной ишемии крыс. Так, рост ЭФПЭ при локальной ишемии мозга составил 23%, при глобальной – 11% от уровня значений интактных животных.

 

Таблица 1 Электрофоретическая подвижность эритроцитов (мкм*см/В*с) крови крыс при хронической ишемии головного мозга

 Время после воздействия

Интактные животные

Модели хронической ишемии головного мозга

локальная

глобальная

15 мин

1,28+0,04

1,34+0,08

1,26+0,12

2 часа

1,24+0,05

1,27+0,12

1,30+0,09

24 часа

1,33+0,02

1,29+0,09

1,25+0,08

10 дней

1,37+0,02

0,92+0,04*  

0,86+0,05*

60 дней

1,32+0,02

1,60+0,03*

1,46+0,04*

Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными

 

Исследование концентрации МДА эритроцитов выявило постепенное нарастание уровня данного показателя в ходе развития как глобальной, так и локальной ишемии головного мозга относительно уровня значений интактной группы крыс. Максимальный рост концентрации МДА был выявлен на 10 сутки после альтерации, к 60 суткам значения данного показателя несколько снижались. Наиболее выраженные изменения регистрировались при развитии глобальной ишемии головного мозга (рис.1, табл. 2).

 

Таблица 2 Динамика изменения концентрации МДА в эритроцитах крыс (нмоль/мл) при хронической ишемии головного мозга

 Время после воздействия

Интактные животные

Модели хронической ишемии головного мозга

локальная

глобальная

15 мин

3,82+0,36

4,51+0,58

4,24+0,56

2 часа

3,78+0,38

4,91+0,79

4,61+0,65  

24 часа

4,10+0,33

5,78+0,52*

5,41+0,43*

10 дней

4,04+0,36

6,38+0,48*

7,35+0,52*

60 дней

3,28+0,24

4,42+0,37*

4,95+0,48*

Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными

 

Исследование состояния глутатиона показало, что к 2-у часу после альтерации наблюдалось увеличение как общего глутатиона, так и восстановленной его формы относительно значений контрольной группы животных (табл. 3).

 

Таблица 3 Динамика изменения восстановленного и окисленного глутатиона в эритроцитах крыс (мг%) при хронической ишемии головного мозга

Время после воздействия

Форма глутатиона

Интактные животные

Модели хронической ишемии головного мозга

Локальная

Глобальная

2 часа

GSН

524,0+20,5

574,0+28,8*

560,6+14,8*

GSSG

24,2+9,5

29,0+8,9

31,5+9,8

Общий

548,2+21,2

603,0+22,8*

592,1+20,8*

24 часа

GSН

504,6+18,8

409,5+22,0*

420,5+28,4*

GSSG

21,6+8,2

45,3+8,7*

42,5+9,2*

Общий

526,2+23,9

484,1+26,5

463,0+29,7

10 дней

GSН

479,4+21,2

271,1+22,8*

244,1+22,0*

GSSG

26,3+5,6

82,8+9,8*

94,7+9,3*

Общий

505,7+22,8

353,9+22,5*

338,8+21,8*

60 дней

GSН

511,9+19,4

285,5+24,4*

180,2+22,0*

GSSG

31,1+8,2

78,3+10,7 *

96,7+14,2*

Общий

543,0+16,8

363,8+28,5*

276,9+22,3*

Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными

 

К 1-м суткам регистрировался рост концентрации GSSG при уменьшении содержания GSН относительно значений контроля. В дальнейшем изменения в системе глутатиона выражались снижением общего глутатиона и GSН, при увеличении концентрации GSSG относительно контроля.

 

Рис. 2. Изменение электрофоретической подвижности эритроцитов, концентрации малонового диальдегида и общего глутатиона больных дисциркуляторной энцефалопатией

По оси ординат — % изменения уровня исследуемых показателей, к 100 % — уровня значений возрастной нормы.

Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с возрастной нормой

 

Полученные результаты свидетельствуют, что при моделировании ишемии головного мозга у животных в течение первых 10 суток эксперимента наблюдается постепенное снижение ЭФПЭ сопровождающееся увеличением концентрации МДА, тогда как рост глутатиона регистрируется на начальном (до 24 часов) периоде времени. Дальнейшим нарастание ЭФПЭ (к 60 суткам альтерации организма) происходит на фоне относительного снижения концентрации МДА (при этом уровень МДА остается повышенным относительно значений интактной группы животных) и снижения содержания общего и восстановленного глутатиона при сохранении повышенного количества окисленной его формы. Вероятно, на начальном периоде развития гипоксии рост общего и восстановленного глутатиона свидетельствует о мобилизации резервов низкомолекулярных антиоксидантов, при которой развиваются метаболические перестройки, направленные как на усиление синтеза, так и восстановление окисленной формы глутатиона. Вместе с тем, внутриклеточные ресурсы системы глутатиона ограничены и, вероятно, при действии длительного стресса, емкость данной системы уменьшается и оксидативный процесс, развивающийся в результате накопления продуктов ПОЛ, сдерживается за счет других антиоксидантных систем эритроцита.

Обоснованность выявленных тенденций в ответ на действие хронического стресса подтверждены исследованиями крови больных дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) на разных стадиях заболевания.

Изучение хронического стресса у больных, развивающегося на фоне ДЭ показало следующую картину изменения исследуемых параметров. Исследования ЭФПЭ крови больных ДЭ выявило, что при поступлении в стационар у пациентов при первой и второй стадиях заболевания ЭФПЭ была повышена по сравнению с возрастной нормой. В отличие от этого, третья стадия заболевания характеризовалась понижением данного показателя относительно ЭФПЭ возрастной нормы (рис. 2, табл. 5). Отмечалось повышение активности перекисного окисления липидов, наиболее выраженное у пациентов с третьей стадией ДЭ.

 

Таблица 4 Электрофоретическая подвижность эритроцитов, концентрация малонового диальдегида, глутатиона при дисциркуляторной энцефалопатии первой, второй и третьей стадии

Показатель

Возрастная норма

Стадии дисциркуляторной энцефалопатии

первая

вторая

третья

ЭФПЭ, мкм*см/В*с

1,22 ± 0,02

1,34 ± 0,03*

1,33±0,02*

1,13 ± 0,12*

МДА, нМоль/л

2,0±0,8

3,0±0,6

3,9±0,7*

4,5±0,9*

Общий глутатион, мг%

147,8±7,4

131,5±8,6

111,2±9,0*

93,0±7,8*

Восстановленный глутатион, мг%

107,9±6,4

79,4±7,9*

89,8±7,2*

49,1±9,9*

Окисленный глутатион, мг%

39,9±5,4

52,1±5,9*

21,4±6,1*

43,9±7,1

Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению с возрастной нормой

 

Исходные показатели системы глутатиона были различны у пациентов на различных стадиях ДЭ (табл. 4). Однако уровень общего глутатиона был снижен относительно здорового контроля у всех пациентов с ДЭ, в наибольшей степени это было выражено в третьей стадии. Различалось и соотношение восстановленного и окисленного глутатиона у пациентов с разной степенью ДЭ: в первой стадии оно составило 1,5, во второй стадии– 4,2, в третьей — 1,1. Показатель соотношения восстановленного и окисленного глутатиона отражает функциональную состоятельность данного механизма антиоксидантной защиты. При первой стадии ДЭ происходит значительная активация глутатионового звена антиоксидантной системы, что приводит к трансформации восстановленного глутатиона в окисленный. Во второй стадии его активность несколько снижается, но соотношение восстановленного и окисленного глутатиона, тем не менее, значимо отличается от нормального уровня. Возможно, на второй стадии большую роль играют другие пути антиоксидантной защиты. При третьей стадии происходит резкое падение уровня восстановленного глутатиона, что, в сочетании со значительным снижением общего глутатиона, указывает на истощение резервов данной антиоксидантной системы.

Анализируя полученные результаты, следует заключить, что усугубление ишемических повреждений головного мозга животных и развитие ДЭ у человека определяют сходные изменения реактивности эритроцитов. При этом ишемия головного мозга у крыс и ДЭ первой и второй стадии вызывают рост ЭФПЭ. Развитие ишемических повреждений головного мозга характеризуется снижением резистентности организма и нарастанием напряжения адаптационных механизмов, приводящих к развитию дизадаптации в ходе развития патологии, что сочетается со снижением уровня ЭФПЭ.

В свою очередь, выявленная направленность изменения ЭФПЭ сочеталась с клиническим статусом больных с ДЭ. Так, у больных ДЭ 1 стадии преобладала субъективная неврологическая симптоматика в виде цефалгического, вестибулярно-атактического, астено-невротического синдромов, легких когнетивных нарушений. В неврологическом статусе выявлялась рассеянная микроочаговая симптоматика. У пациентов 2 стадии имелось не менее двух четко очерченных невратических синдромов, умеренные когнетивные расстройства, в ряде случаев деменция легкой степени тяжести. Пациенты с ДЭ 3 стадии характеризовались наличием грубых двигательных и (или) когнетивных нарушений, приводящих к социальной и бытовой дизадаптации больных.

Обсуждение результатов

Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что моделирование хронического стресс у животных определило сходную с острым стрессом тенденцию изменения ЭФПЭ, выявленную нами ранее, что проявлялось в первоначальном снижении ЭФПЭ с последующим ее увеличением, зависящим от активации стресс-реализующих систем организма [3]. Регистрируемое в опытах первичное уменьшение ЭФПЭ сочеталось с ростом концентраций МДА, тогда как увеличение ЭФПЭ сопровождалось уменьшением процессов ПОЛ. Механизм изменения электроотрицательности мембран эритроцитов, и как следствие изменение ЭФПЭ, может быть опосредован перераспределением заряженных групп на поверхности мембраны при модификации белок-липидного компонента в процессе ПОЛ. Кроме того, нами показано изменение активности наиболее значимого фермента, формирующего поверхностный потенциал клеток, — Na,K-АТФазы, которая является липидзависимым ферментом и может в значительной степени опосредовать изменение ЭФПЭ при стрессе [5]. Хронический стресс у больных в зависимости от стадии заболевания характеризовался ростом ЭФПЭ на 1 и 2 стадии и ее падением на 3 стадии заболевания, с увеличением концентрации МДА. Изменение в системе глутатиона при хроническом стрессе не носило выраженной фазности по сравнению с ЭФПЭ. По всей видимости, развитие хронического стресса приводит к истощению системы глутатиона, которая вероятно эффективна в качестве антиоксидантной системы защиты клеток на начальных этапах стресса.

Таким образом, изменения ЭФПЭ свидетельствует, что при ишемии головного мозга происходит развитии стрессовой реакции с понижением уровня реактивности организма, связанным с активацией процессов ПОЛ на фоне истощения системы глутатиона. При этом характер и выраженность изменений ЭФПЭ являются отражением вовлечения стресс-реализующих систем организма и сопряжены с развитием стресс-реакции, тогда как система глутатиона работает как неспецифическое звено антиоксидантной системы на начальных стадиях адаптационного синдрома, и, по всей видимости, лишь относительно влияет на величину ЭФПЭ.

Список литературы

  1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.
  2. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Изменение электрофоретической подвижности изолированных эритроцитов при действии стресс-факторов // Гематология и трансфузиология. 2011. №5. С. 18-21.
  3. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Гришина А.А. Изменение электрофоретической подвижности эритроцитов и липидного спектра их мембран при различных стрессовых воздействиях // Гематология и трансфузиология. 2010. №3. С. 40-44.
  4. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Захарова О.А., Антипенко Е.А. Неспецифические адаптационные реакции крови при хронической ишемии головного мозга // Клиническая лабораторная диагностика. 2010. №12. С. 28-30.
  5. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Константинова А.И. Электрофоретическая подвижность и активность Nа,К-АТФазы эритроцитов у крыс при стрессе // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2014. Т.100, №11. С. 1297-1302
  6. Матвеев А.Г. Феномен цитотоксичности и механизмы повреждения нейронов новой коры при гипоксии и ишемии // Медицинский журнал. 2004. №2. С.18-23.
  7. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука, 1981. 280 с.
  8. Culman J., Kopin J., Seavedra J.M. Regulation of corticotrophin-releasing hormone and pituitary-adrenocortical response during acute and repeated stress in the rats // Endocrine Regulations. Vol. 25. №3. P. 151-158.
  9. Dallman M. F., Akana S. F., Scribner K. A., Bradbury M.F., Walker C.D., Strack A.M., Cascio C. S. Stress, feedback and facilitation in the hypothalamo-pituitary-adrenal axis // J. Neuroendocrinology. 1992. Vol. 4. №5. P. 517-526.
  10. Kant G. J., Mougey E.H., Meyerhoff J.L. ACTH, prolactin, corticosterone and pituitary cyclic AMP responses to repeated stress // Pharmacol. Biochem. Behav. 1989. Vol. 32. №2. P. 557-561.
  11. Кaiser M.M. Adaptation to stress in physical and mental illness // International society for adaptive medicine (ISAM). VIII World Congress. Moscow. 2006. P.
  12. Natelson B. H., Ottenweller J.E., Cook J.A., Pitman D.L., McCarty R., Tapp W.N. Effect stressor intensity on habituation of the adrenocortical stress response // Physiol. Behav. 1988. Vol. 43. №1. P. 41-46.
  13. Pitman D.L., Ottenweller J.E., Netelson B.H. Plasma corticosterone levels during presentation of two intensities of restraint stress: chronic stress and habituation // Physiol. Behav. 1988. Vol. 43. №1. P. 47-55.
  14. Sedlak J., Lindsey R. Estimation of total protein bound, nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent // Analytical Biochemistry. 1968. №2. P. 192-205.
  15. Young E.A., Akana S., Dallman M.F. Desreased sensitivity to glucocorticoid fast feedback in chronically stressed rats // Neuroendocrinology. 1990. Vol. 51. № 6. P. 536-541.