Раз в месяц мы отправляем дайджест с самыми популярными статьями.

Влияние сред, используемых при искусственном оплодотворении и культивировании эмбрионов, на свободнорадикальное окисление

И.Р. Исхаков1, Р.М. Исхакова2, Д.С. Громенко2, Р.Р. Фархутдинов1

1 Башкирский государственный медицинский университет, Уфа

2 Медицинскийо центр «Семья», Уфа

 

Abstract

We investigated the influence of media used for fertilization and embryo culture on the processes of free radical oxidation. At first stage original media were studied: their influence on the intensity of chemiluminescence in model systems that generate reactive oxygen species, and in which occur lipid peroxidation reactions. At second stage of study we evaluate the influence on chemiluminescence of these same model systems when adding media after fertilization and embryo culture. We define the level of total antioxidant activity and malonic dialdehyde level.

 

Key words: in vitro fertilization, fertilization rate, culture medium

 

Проведено исследование влияния сред, используемых для оплодотворения и культивирования эмбрионов, на процессы свободнорадикального окисления. На 1 этапе изучались исходные среды: их влияние на интенсивность хемилюминесценции в модельных системах, генерирующих активные формы кислорода, и в которых протекают реакции перекисного окисления липидов. На 2 этапе исследования оценивали влияние на хемилюминесценцию этих же модельных систем при добавлении сред, после проведения в них оплодотворения и культивирования эмбрионов. Определяли уровень общей антиоксидантной активности и уровень малонового диальдегида.

Ключевые слова: экстракорпоральное оплодотворение, частота оплодотворения, культуральная среда

 Культуральные среды широко используются в эмбриологии и репродуктивной медицине для оплодотворения и культивирования эмбрионов. Известно, что в процессе жизнедеятельности образуются свободные радикалы: активные формы кислорода (АФК), перекисные радикалы и другие высокореакционные соединения [5]. Свободные радикалы и продукты окисления участвуют во многих жизненно важных процессах. Изменение их содержания вызывает оксидативный стресс, влияет на скорость клеточного деления и рост эмбрионов, способно вызывать повреждение, как целых клеток, так и внутриклеточных структур, приводить к их гибели [2]. До настоящего времени остается неизученным влияние культуральных сред, используемых при искусственном оплодотворении и культивировании эмбрионов, на процессы свободнорадикального окисления (СРО) [3].

Цель исследования: изучить влияние сред, используемых при искусственном оплодотворении, на СРО в модельных системах, изменение СРО в средах после развития эмбриона.

Материалы и методы

Было обследовано 114 пар с диагнозом бесплодие, проходивших диагностику и лечение на базе медицинского центра «Семья» (г. Уфа). Женщинам проводили общеклиническое и гинекологическое обследование, УЗИ органов малого таза, эндоскопическое исследование по показаниям, определяли половые гормоны крови. Мужчины проходили общеклиническое и урологическое обследование, анализировалась спермограмма, проверяли уровень половых гормонов. Индукцию суперовуляции в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) осуществляли по стандартным протоколам [4].

Оплодотворение проводили в среде Fertilization medium (Fm) (SAGE) и оставляли на 18-20 часов в условиях инкубатора. На следующий день пересаживали в Cleavage medium (Cm) (SAGE) и оценивали качество эмбриона. На 3 день пересаживали в Blastocyst medium (Bm) (SAGE) и оценивали качество эмбриона. Пересадив эмбрион из чашки, среду забирали на исследование СРО.

Показатели свободнорадикальной активности измерялись методом регистрации хемилюминесценции (ХЛ) – свечения, возникающего при взаимодействии свободных радикалов, на хемилюминометре ХЛ-003 (Россия) [1]. В модельные системы, в которых инициировали образование свободных радикалов (АФК и перекисных радикалов липидов), добавляли 0,1 мл исследуемой среды.

По характеру изменения ХЛ судили о влиянии сред на СРО. Уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в средах после культивирования эмбрионов определяли по содержанию малонового диальдегида (МДА) набором фирмы «Агат». Общую антиоксидантную активность (ОАА) в этих же пробах определяли набором фирмы «Randox». Математическая обработка полученных результатов производилась с помощью программы Microsoft Excel 2000.

Результаты и обсуждение

Хемилюминесценция модельных систем, в которых вызывалось образование АФК и протекали реакций ПОЛ характеризуются следующими параметрами: спонтанным свечением, быстрой вспышкой в момент введения инициатора, латентным периодом, переходящим в медленную вспышку.

Вначале изучали влияние на СРО исходных сред (ИС), взятых до оплодотворения и культивирования эмбрионов. На рис. Представлено влияние сред на интенсивность ХЛ модельных систем. Исходные значения приняты за 100%. Добавление сред вызывает незначительное увеличение интенсивности ХЛ, связанной с образованием АФК. В то же время уровень ХЛ модельной системы, в которой протекают реакции ПОЛ, практически не меняется (рис.1).

Далее изучали изменение СРО в средах после оплодотворения и культивирования эмбрионов после 5 дней развития в программах ЭКО и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ).

 

Рис.1 Соотношение светосуммы ИС в модельных системах, генерирующей АФК, и с протеканием ПОЛ (за 100% принята светосумма модельных систем)

 

 

Таблица 1. Показатели СРО в исследуемых средах до и после ЭКО и ИКСИ

Среды

ХЛ (100% — светосумма модельной системы)

ОАА

МДА

АФК

ПОЛ

 

ЭКО*

ИКСИ

ЭКО

ИКСИ

ИС

ЭКО*

ИКСИ*

ИС

ЭКО*

ИКСИ*

Fm

136

112

106

108

3,4±

0,09

2,4±

0,07

3,2±

0,05

0,09±

0,05

0,19±

0,04

0,13±

0,02

Cm

123

110

104

104

2,9±

0,06

2,1±

0,03

2,8±

0,07

0,11±

0,03

0,21±

0,03

0,18±

0,03

Bm

115

111

102

101

2,6±

0,06

1,9±

0,06

2,5±

0,08

0,12±

0,05

0,23±

0,04

0,24±

0,07

Статистически достоверные различия (p<0.05) отмечены *.

 

Из таблицы 1 видно, что после добавления сред к модельной системе, генерирующей АФК, светосумма увеличилась, максимально в среде Fm, и практически не изменилась в модельной системе, в которой протекают реакции ПОЛ. Уровень ОАА после искусственного оплодотворения был максимальным в среде для оплодотворения и минимальным в среде для развития бластоцист (табл. 1). Уровень МДА после искусственного оплодотворения был минимальным в среде для оплодотворения и максимальным в среде для развития бластоцист.

Разница между ЭКО и ИКСИ на клеточном уровне в том, что в случае ЭКО в чашке находится ооцит-кумулюсный комплекс, к которому добавляется несколько десятков тысяч сперматозоидов. В случае же ИКСИ кумулюсные клетки удаляются путем денудирования, и в чашке находится ооцит, в который делают микроинъекцию одного сперматозоида.

Таким образом, выявлено, что среды, используемые при искусственном оплодотворении и культивировании, вызывают повышение интенсивности ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, и не влияют на реакции ПОЛ в модельной системе. После проведения искусственного оплодотворения все исследуемые среды увеличили интенсивность ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, максимально в среде Fm. Исследуемые среды не вызвали значимого изменения интенсивности ХЛ в модельной системе, в которой происходят реакции ПОЛ. После проведения искусственного оплодотворения влияние исследуемых сред на интенсивность ХЛ этой модельной системы практически не изменилось.

Уровень ОАА после оплодотворения в среде Fm оставался практически неизменным, а в остальных средах понижался. Уровень МДА после оплодотворения в средах для культивирования эмбрионов становился выше.

Выводы

Среды, используемые для оплодотворения и культивирования эмбрионов, при добавлении в модельные системы повышают интенсивность ХЛ, связанную с генерацией АФК, и не влияют на ХЛ, сопровождающую ПОЛ.

  1. В процессе оплодотворения и культивирования эмбрионов повышается влияние исследуемых сред на ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, и не меняется интенсивность ХЛ, сопровождающая ПОЛ.
  2. В исследуемых средах после искусственного оплодотворения снижается уровень ОАА и повышается содержание МДА.

Список литературы

  1. Фархутдинов Р.Р., Громенко Д.С. Воздействие биофлафоноидов прополиса на процессы липопероксидации в гонадах крыс при интоксикации полихлорированными бифенилами // Вопросы питания. 2008. №6. С. 9-14.
  2. Al-Gubory K.H., Fowler P.A., Garrel C. The roles of cellular reactive oxygen species, oxidative stress and antioxidants in pregnancy outcomes // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010. Vol. 42. P. 1634-1650.
  3. Elder K., Dale B. In vitro fertilization. М., 2008.
  4. Maheshwari A., Griffiths S., Bhattacharya S. Global variations in the uptake of single embryo transfer // Human reproduction update. 2011. №1. P. 107-120.
  5. Tamura H., Takasaki A. et al. Oxidative stress impairs oocyte quality and melatonin protects oocytes from free radical damage and improves fertilization rate // J. Pineal Res. 2008. Vol. 44. P. 280-287.